Erstatter glyfosat for glycin i proteiner fra aktivt oppdelte pattedyrceller?

[email protected]
18. august 2019

Et papir ble nylig publisert av Antoniou et al. med den dristige tittelen “Glyphosate erstatter ikke glycin i proteiner som aktivt deler pattedyrceller.” [1]. Papiret involverte å eksponere humane brystkreftceller for glyfosat i seks dager, og deretter bruke en sofistikert teknikk kalt Tandem massemerke (TMT) merking for å identifisere korte peptider som angivelig inneholder unormalt tunge glycinmolekyler. Proteiner fra både de behandlede og ubehandlede cellene ble satt gjennom en standardprotokoll som involverte massespektrometri, delvis proteolyse og videre analyse, som beskrevet i papiret.

Cellene ble holdt på en rik ernæringsformulering kalt Dulbeccos Modified Eagle Medium. Denne formuleringen er en modifikasjon av den opprinnelige Basal Medium Eagle som er firdoblet med aminosyrer og vitaminer. Den har også en høy konsentrasjon av glukose ved 4500 mg/L. Det er ingen garanti for at det ikke er forurenset med glyfosat. Videre hadde cellene blitt dyrket i kultur i en del ubestemt tid tidligere, og sannsynligvis hadde de samlet et betydelig antall feilfoldede glyfosatforurensede proteiner som var vanskelige å fjerne. De begynte sannsynligvis livet sitt i kultur allerede med glyfosatforurensede proteiner, gjennom livstidens eksponering for glyfosat fra mennesket som opprinnelig huser disse cellene i en brystsvulst.

Forfatterne testet prøvene for to forskjellige posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM): glyoksylat-modifisert cystein og glyfosatsubstitusjon for glycin. De inkluderte glyoksylatmodifiseringen fordi de antok at glyfosat kan brytes ned til glyoksylat, som er i stand til å binde seg til cysteinrester. Spesielt oppdaget de ikke noen glykoksylat-modifiserte cystein i verken kontrollcellene eller de behandlede cellene.

I kontrast fant forfatterne et betydelig signal for tilstedeværelse av glyfosat i flere korte peptider i de behandlede prøvene. Imidlertid fant de også et like sterkt signal i de ubehandlede prøvene. De skrev: “I dette eksperimentet forventes imidlertid ingen av de to antatte PTM-ene (post-translationelle modifikasjoner) av interesse å være til stede i fravær av glyfosatbehandling. Det var således mulig å bruke TMT-merking for å identifisere og filtrere ut eventuelle potensielle falske funn.” Og så: “Dataene viser avgjørende at alle kandidatsubstituerte peptider er falske funn.”

Et like plausibelt argument er imidlertid at de “ubehandlede” cellene også inneholder glyfosatsubstituerte proteiner. Potensielt er de fleste om ikke alle kandidatsubstituerte peptidene sanne funn. Fordi både de behandlede og kontrollcellene hadde vært utsatt for glyfosat i lang tid tidligere, er det sannsynlig at de begge hadde akkumulert glyfosatforurensede proteiner i nesten like store mengder. Anthony Samsel og jeg diskuterte i vår første artikkel om glyfosatsubstitusjon for glycinbevis for at N-substituerte glyciner kan danne peptoider som er svært vanskelige å bryte ned, og at fosfonater har vist seg å ha en evne til å hemme proteolyse [2].

Tanken om at glyfosateksponering resulterer i akkumulering av proteolyseresistente proteiner støttes av en studie publisert i 2013 på erteplanter [3]. Forfatterne observerte en akkumulering av ubiquitinerte proteiner sammen med oppregulering av proteolyseenzymer, noe som er overraskende og uvanlig. De skrev:

“Akkumuleringen av ubiquitinerte proteiner, sammen med økt antatt proteasomaktivitet ble observert gjennom ABPP [Aktivitetsbasert proteinprofilering], noe som indikerer en rolle for proteasomet ved herbicidbehandling. Akkumulering av ubiquitinerte proteiner har typisk blitt beskrevet i forbindelse med en samtidig reduksjon i proteasomaktivitet. Resultatene våre viste likevel økning i både proteasomsubstratnivåer og aktiviteter. Dermed kan det herbicidinduserte stresset på proteomet resultere i akkumulering av allestedsnærværende proteiner, til tross for økt proteasomaktivitet, eller den økte tilgjengeligheten av substratet indusere proteasomaktivitet.”

En sannsynlig forklaring er at glyfosat innebygd i proteinene forstyrrer proteolytiske enzymers evne til å nedbryte det. Faktisk, i et papir som knytter glyfosat til amyotrofisk lateral sklerose (ALS), beskrev vi hvordan glyfosat kunne forstyrre selve ubiquitineringsprosessen, som markerer proteiner for sletting av proteasomet [4]. Vi skrev:

“Det mest spennende er det faktum at ubiquitin i seg selv avhenger kritisk av et høyt konservert karboksin-terminal dobbeltglycinpar for å bygge de komplekse ubiquitinkjedene som signaliserer et protein for nedbrytning [46] [gjengitt her som [5]]. Substitusjon av glyfosat for en av disse essensielle glysinene forventes å svekke prosessen med resirkulering av feilfoldede proteiner. Dette kan lett forklare akkumuleringen av feilfoldede proteiner som er et kjennetegn ved ALS.”

Heldigvis for oss, Antoniou et al. [1] ga i Tabell 3 de nøyaktige sekvensene med glyfosatsubstitusjoner som ble oppdaget, og Uniprot-nettstedet gir et verktøy der man kan finne proteiner som inneholder spesifikke sekvenser, ved hjelp av en programvarepakke kalt BLAST. Uniprot var i stand til å hente identiteten til alle de 15 proteinene som ble gitt som treff i deres figur 3, med en nøyaktig samsvar med en sekvens tilstede i hvert protein. Alle 15 proteinene var humane proteiner. Minst ni av disse proteinene binder til fosfatholdige molekyler, som oppregnet i tabell 1. Dette gir støtte for ideen om at proteiner som binder fosfat er spesielt utsatt for glyfosatsubstitusjon, slik det ble artikulert i en fersk artikkel publisert av Gunatilake et al. [6], og foreslår at glyfosat er en viktig faktor i kronisk nyresykdom av ukjent etiologi (CKDu) blant landbruksarbeidere i Sri Lanka. Faktisk inneholder protein EPSP-syntase i planter som antas å være hovedmålet for glyfosat ved avliving av ugress, en meget konservert glycinrest på stedet der fosfoenolpyruvat (PEP) binder. Forskere fra DowDupont har vært i stand til å bruke CRISPR-teknologi for å skape en maisstamme som er resistent mot glyfosat, på grunn av et CRISPR-modifisert gen for EPSP-syntase [7]. Det første trinnet de gjorde var å endre DNA-koden for å erstatte glycinet på PEP-bindingsstedet med alanin. Dette resulterte i en versjon av enzymet som var helt ufølsom for glyfosat.

Tabell 1: Ni proteiner som inneholder glyfosatsubstituerte peptider, som identifisert ved hjelp av Tandem massemerke (TMT) spektrometriverktøy. Disse peptidene, sammen med 6 til, ble funnet i kreftceller dyrket i kultur. Alle ni binder seg til fosfatholdige molekyler som angitt i tredje kolonne. Den første kolonnen gir den påviste sekvensen, der “*” indikerer en glycinrest som ble funnet å være substituert. Se: Antoniou et al. (2019) for detaljer om eksperimentoppsettet.

Til sammen avslører tabell 1 en spennende liste over humane proteiner, og det forventes at mange av dem kommer til uttrykk i brystkreftceller. For eksempel er den ene et RNA-metyleringsprotein (tRNA (guanin (10) -N2)-metyltransferasehomolog). En annen har tumorundertrykkende funksjon gjennom Akt-inhibering, ved binding til fosfatidylinositolfosfater (Pleckstrin-homologi-domeneholdig familie A medlem 5). En annen er en G-proteinkoblet reseptor (GPCR). Ifølge Bar-Shavit et al., “GPCR kontrollerer mange funksjoner ved tumorigenese, inkludert immuncellemedierte funksjoner, spredning, invasjon og overlevelse på det sekundære stedet.” [8] Et annet hit er et homeobox-protein, og denne proteinklassen antas spesifikt å spille en årsaksrolle i brystkreft [9].

En annen viktig oppdagelse fra denne artikkelen er de to proteinene som ble identifisert som statistisk signifikant oppregulert som svar på den seks-dagers glyfosatbehandlingen. Disse er: ADP/ATP nukleotidtranslokase (ANT) og serin/argininrik skjøtingsfaktor 6 (SRSF6) [1]. Disse to proteinene viser seg å være veldig interessante, fordi begge er kjent for å være overuttrykt i tumorceller, og i begge tilfeller er høyere nivåer av disse proteinene knyttet til dårlig utfall hos kreftpasienter.

SRSF6 er et medlem av familien av skjøtingsfaktorer som har kraftige evner til å endre proteinuttrykk, ved å endre hvordan peptider er satt sammen fra individuelle eksoner. Overekspresjon av SRSF6 i lungepitelceller forbedret spredning, beskyttet dem mot cellegift og økte deres evne til å danne svulster [10]. Videre reduserte nedslag av SRSF6 i lunge-og tykktarmskreftcellelinjer deres tumorigene potensiale. SRSF6 kommer ofte til uttrykk i hudkreft, og det endrer spleising av et protein kalt tenascin C for å fremme invasiv og metastatisk kreft [11]. SRSF6 forårsaker også overdreven spredning av keratinocytter, et karakteristisk trekk ved psoriasis [12]. Hvis glyfosat forårsaker at SRSF6 blir oppregulert i brystkreftceller, forårsaker det sannsynligvis forbedret tumorigenese hos utsatte mennesker.

ANT kommer i flere forskjellige isoformer med forskjellige effekter på cellebiologi, men den som er høyt uttrykt i brystkreftceller er ANT2, og det har vist seg å være viktig for å opprettholde svulstoverlevelse. ANT2s jobb er å transportere ATP inn i mitokondriene, og denne aktiviteten er viktig når en celle arbeider under forutsetningene om Warburg-effekten. Kreftceller produserer mye av ATP i cytoplasma gjennom glykolyse, og deretter bærer ANT2 ATP inn i mitokondriene slik at de kan redusere mengden ATP de trenger å produsere gjennom oksidativ fosforylering. Dette er en god strategi for å beskytte mot oksidativ skade, spesielt når mitokondrier kan være dysfunksjonelle på grunn av DNA-mutasjoner på grunn av giftig eksponering. ANT2 programmerer faktisk en celle for å implementere strategier som fører til økt spredning i stedet for apoptose (celledød) i nærvær av stressorer [13]. Det har nylig vært interesse for å utvikle medisiner som bekjemper kreft ved å undertrykke ANT2-aktivitet [14].

Antoniou et al. papir kan være et betydelig gjennombrudd i vår søken etter en prosedyre for å oppdage glyfosatforurensning i proteiner. Det er bemerkelsesverdig at de var i stand til å identifisere 15 humane proteiner som ser ut til å ha blitt modifisert gjennom glyfosatsubstitusjon for en spesifikk glycinrest. Papiret har stor verdi for samfunnet generelt, fordi det spesifiserer en foreskrevet prosedyre som nå kan brukes ganske rutinemessig på flere andre celletyper dyrket i kultur, så vel som på biologiske prøver ekstrahert fra sykt vev hos pattedyr, for eksempel negler av sklerodermipasienter, hudceller hos psoriasispasienter, hårprøver av autistiske barn, hover av hester som lider av grunnlegger, tumorbiopsier, Alzheimers plakk postmortem, sykt nyre-og levervev osv.

Fremtidige muligheter for å oppdage glyfosatforurensede proteiner florerer, og når vi samler en database med spesifikke substitusjonsmønstre, kan vi til og med være i stand til å forutsi regler for peptidkontekster der glycinrester er spesielt utsatt, for eksempel når nærliggende aminosyrer er små (for å forhindre sterisk hindring) eller positivt ladet (for å tiltrekke glyfosat til stedet for peptidsamlingen på grunn av dets negative ladning). Faktisk er disse typer regler allerede blitt tydelige i det lille settet hentet i Antoniou et al. eksperiment. Seks av de 15 påståtte substituerte glysinene ble umiddelbart etterfulgt av en positivt ladet aminosyre (lysin, histidin eller arginin). Og ti ble umiddelbart innledet av en av valin, leucin, serin eller treonin, som alle er små aminosyrer, som støtter rom for glyfosats metylfosfonylhale. Hvis glyfosat virkelig erstatter glycin under proteinsyntese, er konsekvensene mindboggling, og de lumske kumulative toksiske effektene av glyfosat kan lett forklare økningen vi ser i dag i forekomsten av en lang liste over autoimmune, metabolske, nevrologiske og onkologiske sykdommer.

Referanser

[1] MN Antoniou et al. Glyphosate does not substitute for glycine in proteins of actively dividing mammalian cells. BMC Res Notes 2019; 12:494. (Weblink)
[2] A Samsel and S Seneff. Glyphosate, pathways to modern diseases V: Amino acid analogue of glycine in diverse proteins. Journal of Biological Physics and Chemistry 2016; 16: 9-46. (Weblink) (Nedlasting)
[3] A Zulet et al. Proteolytic Pathways Induced by Herbicides That Inhibit Amino Acid Biosynthesis. PLoS ONE 2013; 8(9): e73847. (Weblink)
[4] S Seneff et al. Does glyphosate acting as a glycine analogue contribute to ALS? J Bioinfo Proteomics Rev 2016: 2(3): 1-21. (Weblink) (Nedlasting)
[5] A Zuin et al. Ubiquitin signaling: Extreme conservation as a source of diversity. Cells 2014; 3(3): 690-701. (Weblink)
[6] S Gunatilake et al. Glyphosate’s Synergistic Toxicity in Combination with Other Factors as a Cause of Chronic Kidney Disease of Unknown Origin. Int J Environ Res Public Health 2019; 16(15). pii: E2734. (Weblink) (Nedlasting)
[7] Y Dong et al. Desensitizing plant EPSP synthase to glyphosate: Optimized global sequence context accommodates a glycine-to-alanine change in the active site. J Biol Chem 2019; 294(2): 716-725. (Weblink)
[8] R Bar-Shavit et al. G Protein-Coupled Receptors in Cancer. Int J Mol Sci 2016; 17(8). pii: E1320. (Weblink)
[9] MT Lewis. Homeobox genes in mammary gland development and neoplasia. Breast Cancer Research 2000; 2: 159. (Weblink)
[10] M Cohen-Eliav et al. The splicing factor SRSF6 is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers. J Pathol 2013; 229(4): 630-9. (Weblink)
[11] MA Jensen et al. Splicing factor SRSF6 promotes hyperplasia of sensitized skin. Nat Struct Mol Biol 2014; 21(2): 189197. (Weblink)
[12] H Valdimarsson et al. Psoriasis: a disease of abnormal Keratinocyte proliferation induced by T lymphocytes. Immunol Today 1986; 7(9): 256-9. (Weblink)
[13] SH Baik and J Lee. Adenine nucleotide translocase 2: an emerging player in cancer. J Stem Cell Res Med 2016; 1(2): 66-68. (Weblink)
[14] J-Y Jang et al. Suppression of adenine nucleotide translocase-2 by vector-based siRNA in human breast cancer cells induces apoptosis and inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research 2008; 10(1): R11. (Weblink)

Erstatter glyfosat for glycin i proteiner fra aktivt oppdelte pattedyrceller? av Stephanie Seneff er lisensiert under en Creative Commons Attribution 3.0 United States License.