Kromatografi

Original English version: https://people.rit.edu/pac8612/webionex/website/html/ione8ho9.html

Kromatografi er en separasjonsprosess som innebærer å partisjonere et protein (eller en annen løselig analytt) mellom en uoppløselig stasjonær fase og en mobil fase som passerer over dens overflate. En enkel, men fullstendig, kromatografi system er vist i diagrammet nedenfor.

Kromatogram: registreringen av en separasjon produsert av en opptaker eller integrator basert på signalet oppnådd fra detektoren.

t_m: den nødvendige tid for den mobile fasen for å reise hele lengden av kolonnen. For eksempel, hvis søyle har et totalt volum på 100 ml og den stasjonære fase opptar 40 ml, deretter den mobile fase opptar 60 ml. Dersom den mobile fasen var som strømmer med en hastighet på 5 ml/min, da det ville ta 12 min for den mobile fasen for å reise fra injektoren til detektoren gjennom kolonnen. Den t_m  kan noen ganger bli bestemt ved å identifisere en liten topp i kromatogrammet tidlig som følge av en litt forskjellig løsningsmiddel i den mobile pausen som kommer fra den innførte prøveporsjon. Den t_m kan også bestemmes ved å kontrollere eluering av en prøve som ikke holdes tilbake av den stasjonære fase i det hele tatt. I tilfelle av en kationbytteharpiks, kan en negativt ladet protein bli brukt til å bestemme t_m. Det skal også bemerkes at andre faktorer, inklusive lengden og diameteren av rør som kobler injektoren og detektoren til kolonnen vil kunne påvirke t_m – verdier.

Når en analytt av noe slag gjennomgår kromatografi, er det beveger seg med samme hastighet som den mobile fase når den er i den mobile fase, og det er i ro når det er bundet til den stasjonære fasen. Med andre ord, alle analytter bruke tid tilsvarende t_m i den mobile fasen. Forskjeller i mengden av tid de bruker bundet til den stasjonære fasen gjøre dem i stand til å skilles fra hverandre.

t_r: retensjonstiden, eller tiden som kreves for at et protein elueres fra en kolonne.

t_r‘: den justerte retensjonstiden, som beskriver hvor mye tid proteinet ble brukt bundet til den stasjonære fasen under en separasjon.

k’: kapasitetsfaktoren, kan bestemmes av ligningen nedenfor. k’ brukes til å sammenligne kromatografisk oppførsel av en analyt i samme kolonne når den er koblet til to forskjellige systemer. I så fall t_m verdiene kan variere, men k’ verdiene skal forbli de samme. Kapasitetsfaktoren indikerer også antall kolonnevolumer av mobilpause som må brukes for å eluere en analyt. k’ verdien av 1 indikerer at 2 kolonnevolum av mobilfase må brukes, mens a k’ verdien av 5 indikerer at 6 kolonnevolum må brukes.

V_r: retensjonsvolum er proporsjonalt med retensjonstid, basert på den konstante strømningshastigheten til et kromatografisystem. Hvis retensjonstiden er 5 minutter og volumstrømningshastigheten (u_v) er 5 mL/min, V_r er 25 mL.

V_m: mobilfasevolum (også kjent som tomrom)

Relativ oppbevaring (a): forholdet mellom kapasitetsfaktorer (k�) eller justerte oppbevaringstider (t_r�) for to analysater. Etter stevne, a > 1.

Oppløsning: graden av separasjon mellom to analytter på et kromatografisystem. I det ovennevnte kromatogram sies forbindelse A og forbindelse B å være “baseline-resolved”, mens forbindelse B og forbindelse C ikke er godt oppløst. Oppløsningen kan beregnes ut fra følgende ligning.

hvor w_ave er gjennomsnittet av de to toppbreddene i tidsenheter. En andre ligning for oppløsning er nyttig for dens prediktive verdi ved utforming av separasjoner:

hvor N er antall teoretiske plater for separasjonen.